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谷氨酸棒桿菌醫(yī)藥蛋白表達(dá)體系
技術(shù)類型： 非專利技術(shù)
交易方式： 完全轉(zhuǎn)讓
專利號(hào)：2019101879146
技術(shù)詳細(xì)介紹
1、簡(jiǎn)介
谷氨酸棒桿菌（Corynebacterium glutamicum）被廣泛用于食品工業(yè)生產(chǎn)，是一種安全性很高的工業(yè)菌株；具有包括Sec 和Tat 分泌途徑在內(nèi)完善的蛋白分泌系統(tǒng)；沒(méi)有類似于大腸桿菌（E。 coli）所帶來(lái)的內(nèi)毒素和宿主細(xì)胞蛋白污染等問(wèn)題（表1）。這些顯著優(yōu)點(diǎn)使它成為一種有吸引力的外源蛋白表達(dá)生產(chǎn)用的底盤細(xì)胞。目前國(guó)內(nèi)生物醫(yī)藥領(lǐng)域主要依賴于E。coli 表達(dá)體系生產(chǎn)醫(yī)藥蛋白，原創(chuàng)性外源蛋白表達(dá)體系的缺失，在知識(shí)產(chǎn)權(quán)方面將制約到我國(guó)生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。該項(xiàng)成果有望為我國(guó)生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)提供一個(gè)具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的谷氨酸棒桿菌安全高效外源蛋白表達(dá)體系。
表1大腸桿菌和谷氨酸棒桿菌表達(dá)系統(tǒng)比較
特別是2020年國(guó)家推出全面禁止在動(dòng)物飼料中添加抗生素的政策，極大增加了我國(guó)畜牧業(yè)對(duì)獸用細(xì)菌疫苗的需求。獸用疫苗中，利用細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)的基因工程疫苗因交叉免疫效果好在預(yù)防禽畜疫病方面具有廣闊應(yīng)用前景。利用C。 glutamicum表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)獸用疫苗蛋白，可以降低內(nèi)毒素，強(qiáng)化可溶性表達(dá)，簡(jiǎn)化下游蛋白分離純化過(guò)程，表現(xiàn)出了顯著的過(guò)程集成效應(yīng)。（圖1）。通過(guò)近年來(lái)團(tuán)隊(duì)的不斷努力，我們初步開(kāi)發(fā)的基于谷氨酸棒桿菌的可溶性高效蛋白表達(dá)體系已成功地解決了多家醫(yī)藥企業(yè)的生產(chǎn)過(guò)程技術(shù)與知識(shí)產(chǎn)權(quán)問(wèn)題，比如目前利用谷氨酸棒桿菌宿主所構(gòu)建的豬胸膜肺炎疫苗蛋白Omp、腦鈉肽BNP、前膠原肽PINP分泌表達(dá)工程菌株均已具備工業(yè)應(yīng)用潛力。
2、創(chuàng)新要點(diǎn)
該項(xiàng)目利用先進(jìn)的合成生物學(xué)、分子生物學(xué)以及高通量培養(yǎng)篩選系統(tǒng)，創(chuàng)制了具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的谷氨酸棒桿菌安全高效外源蛋白表達(dá)體系，處于國(guó)際先進(jìn)水平。
技術(shù)上創(chuàng)新：本項(xiàng)目開(kāi)發(fā)了適合谷氨酸棒桿菌重組蛋白表達(dá)的元器件、基因編輯工具以及高效的底盤細(xì)胞。具體包括雙順?lè)醋颖磉_(dá)結(jié)構(gòu)、高效的組成型和誘導(dǎo)型啟動(dòng)子、能夠正確引導(dǎo)重組蛋白分泌的高效信號(hào)肽以及適用于C。glutamicum 的CRIPSR-Cas9 基因編輯工具，并將其應(yīng)用到宿主細(xì)胞的改造中。在底盤細(xì)胞改造方面，基于改造底盤細(xì)胞代謝流趨向于重組蛋白表達(dá)有利方向的研究思路，通過(guò)轉(zhuǎn)錄組、多變?cè)治龅确椒▽ふ腋脑斓妆P細(xì)胞的遺傳位點(diǎn)，構(gòu)建了顯著提高重組蛋白表達(dá)的一系列突變體菌株。
結(jié)果上創(chuàng)新：目前國(guó)內(nèi)外藥用蛋白的表達(dá)生產(chǎn)主要依賴于大腸桿菌表達(dá)體系，形成了系列化專利壁壘，而我國(guó)在原創(chuàng)性外源蛋白表達(dá)體系研究領(lǐng)域的落后和菌株知識(shí)產(chǎn)權(quán)的缺乏，已經(jīng)呈現(xiàn)出制約到我國(guó)生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展的態(tài)勢(shì)。本項(xiàng)目以具有自由知識(shí)產(chǎn)權(quán)出發(fā)菌株為基礎(chǔ)，基于系統(tǒng)的細(xì)胞工廠創(chuàng)制技術(shù)體系，能夠從源頭上規(guī)避許多已有的基于已知生物學(xué)“知識(shí)”的基因工程和代謝工程手段所形成的專利壁壘，為我國(guó)藥用蛋白的生產(chǎn)提供了一種高效自主的微生物表達(dá)體系。
3、關(guān)鍵指標(biāo)
（1）蛋白產(chǎn)品無(wú)內(nèi)毒；
?。?）目標(biāo)蛋白產(chǎn)量達(dá)到工業(yè)生產(chǎn)需求；
（3）蛋白純化生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單；
（4）產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定可控、生產(chǎn)成本低。
4、知識(shí)產(chǎn)權(quán)
[1] 一種適用于谷氨酸棒桿菌的表達(dá)載體及其應(yīng)用ZL201610626318X。
[2] α-淀粉酶的制備ZL201610836135。0。
[3] 一種適用于谷氨酸棒桿菌的增強(qiáng)型表達(dá)載體，CN201910187914。6。
[4]一種谷氨酸棒狀桿菌重組菌、制備方法及應(yīng)用， CN201919197943。7。
[5] 一種谷氨酸棒狀桿菌重組菌、制備方法及應(yīng)用， CN201919197941。8。
[6]一種適用于谷氨酸棒桿菌分泌表達(dá)木聚糖酶的重組載體、表達(dá)系統(tǒng)和應(yīng)用， CN2019101076369。
[7]一種適用于谷氨酸棒桿菌重組表達(dá)載體、外源蛋白表達(dá)系統(tǒng)、應(yīng)用和木聚糖酶的制備方法， CN2018110154413。
[8]一種谷氨酸棒桿菌內(nèi)源的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子、載體及其應(yīng)用， PCT/CN2018/110217
[9] 操縱子、其載體及其應(yīng)用， CN2018109902517。
[10] 啟動(dòng)子、其載體及其應(yīng)用， CN2018109901800。
[11] 一種含有乙醇誘導(dǎo)啟動(dòng)子的質(zhì)粒載體及其在提高谷氨酸棒桿菌重組蛋白表達(dá)量中的應(yīng)用， CN201810494641。5。
[12] 一種提高谷氨酸棒桿菌重組蛋白表達(dá)量的方法， CN201810494617。1。
[13] 一種重組谷氨酸棒狀桿菌、其制備方法及其應(yīng)用， CN201711334447。2。
[14]一種谷氨酸棒桿菌的基因編輯載體、制備方法、系統(tǒng)及其應(yīng)用， CN201710576441。X。
[15]一種谷氨酸棒狀桿菌的基因編輯系統(tǒng)及其應(yīng)用， CN201611141549。8。
[16] 一種適用于谷氨酸棒桿菌的表達(dá)載體及其應(yīng)用， CN201610619141。0。
[17] 一種適用于谷氨酸棒桿菌的外源啟動(dòng)子及其應(yīng)用， CN201610613983。5。
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